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產物純化清除內毒素

發(fā)布時間: 2023-09-01  點擊次數(shù): 827次

產物的純化可以有效地去除內毒素﹐常用的純化流程由幾個層析步驟組成,包括離子交換、疏水相互作用層析和凝膠過濾色譜法。一般來說,起初,高內毒素含量的產物通過上述過程的純化而不再經別的特殊處理就能將內毒素減少至100EU/ml左右,甚至更低。如重組α1-抗-胰-蛋-白-酶在粗制的細胞勻漿中濃度為1.2×107EU/ml,當采用超濾﹑離子交換和固定的金屬螯合物吸附層析法三步純化后,終產物中的內毒素含量小于0.22 EU/ml。

8.31產物純化清除內毒素.png

另外,雖然有幾種吸附步驟的混合使用,但在最終產物中仍有相當量的內毒素未能被清除。雖然在通過陽離子交換和肝素吸附劑等無菌層析后,蛋白質的純化度可達到99%以上,但是最終產物中的內毒素含量仍有14EU/ml。再如,在純化的鼠IgG1預備物(PI=5.5)中微生物污染是很少的,經過立即無菌過濾后,內毒素和 IgG1分別為100EU/ml3EU/ml。此時再用其他方法(包括離子交換、疏水相互作用和蛋白質A親和層析)再處理此IgG1溶液并未能進一步去除所含的內毒素。同樣,當多黏菌素B或組胺酸用作層析柱時,在大劑量的樣品情況下,不能有效地將內毒素減少到一個理想的限度以下。而在處理少量的樣品時則可以一定程度地減少內毒素,但問題是會丟失相對大量的產物。

蛋白質和內毒素分子的特性對于蛋白質和內毒素的進一步減少有獨-特的影響。如針對堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)的內毒素選擇性吸附劑是以聚乙胺葡聚糖為基礎的,能成功地在負性層析模型中進行。當內毒素被吸附的同時,bFGF的殘留可以避免。對IgG1來說,只有特殊的內毒素選擇性吸附劑是成功的。

在制藥工業(yè)上有一些可選擇的方法可以得到低內毒素含量的產物,這些方法之間的差異表現(xiàn)在內毒素清除時魚和熊掌不能兼得的問題。因為藥用性蛋白質的酸堿性不同,在制造過程中需要的合適環(huán)境也不同,所以不能采用完-全相同的方法來去除其中的內毒素。例如,離子交換層析對尿-激-酶或bFGF等堿性蛋白質的去污染有用,而對酸性蛋白質則因為吸附因素的作用將會同時伴有產物的丟失。小分子蛋白質如肌球蛋白(相對分子質量為18000)可用于超濾法去除大的內毒素聚合物,而對大分子蛋白質如免疫球蛋白(相對分子質量為150000)來說,超濾則不起作用。此外,如果內毒素和蛋白質的相互作用使內毒素單體通過細胞膜滲透到蛋白質中,則此時超濾也是無效的。

由于產物多種多樣,人們期望用一個統(tǒng)一適用的內毒素清除方法是不切實際的。另一方面,由于所采用技術的不同也說明,在純化步驟的改進時,內毒素分子的特殊性質并不總是被完-全考慮到的。



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