在醫(yī)療產(chǎn)品的質(zhì)量保證過(guò)程中，無(wú)菌檢驗(yàn)是不可少的。對(duì)于腸外藥品來(lái)說(shuō)，避免出現(xiàn)發(fā)熱原至關(guān)重要。這些致熱物質(zhì)（內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素）在標(biāo)準(zhǔn)滅菌過(guò)程中無(wú)法消除，一旦進(jìn)入血液就會(huì)產(chǎn)生生物活性，對(duì)人體健康造成危害，輕則引起輕微反應(yīng)（如發(fā)燒），重則導(dǎo)致膿毒性休克和死亡。因此，對(duì)注射制劑開展熱原檢測(cè)是不可少的流程。

一、熱原測(cè)試方法的演進(jìn)

自20世紀(jì)以來(lái)，熱原測(cè)試方法不斷發(fā)展。20世紀(jì)40年代，家兔熱原檢測(cè)（Rabbit Pyrogen Test，RPT）作為基于發(fā)熱反應(yīng)終點(diǎn)的體內(nèi)檢測(cè)方式出現(xiàn)。該方法通過(guò)向兔子耳靜脈注入試驗(yàn)物質(zhì)，監(jiān)測(cè)其直腸體溫變化來(lái)判斷是否存在熱原污染。

然而，RPT方法存在諸多局限性。它容易受到兔子飼養(yǎng)條件、種類差異等因素的干擾，無(wú)法檢測(cè)特定物質(zhì)，而且在醫(yī)療器械植入時(shí)容易出現(xiàn)局部反應(yīng)。此外，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果不能直接應(yīng)用于人體，但由于其能檢測(cè)未定性熱原，至今仍被視為熱原檢測(cè)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)"。不過(guò)，這一方法在歐洲每年用于腸外藥物試驗(yàn)的兔子超過(guò)10,000只，給動(dòng)物帶來(lái)了極大的壓力。

二、尋求替代：從3R戰(zhàn)略到新方法的探索

鑒于RPT方法的局限性，自1986年起，歐洲藥典委員會(huì)積極實(shí)施3R戰(zhàn)略，致力于開發(fā)替代方法。經(jīng)過(guò)多年努力，2021年歐洲藥典委員會(huì)決定在五年內(nèi)用先進(jìn)的體外檢測(cè)（如MAT）完-全取代RPT。2024年6月，該委員會(huì)正式批準(zhǔn)從所有條款中刪除家兔檢測(cè)，修訂文本將于2025年7月1日生效。

在RPT方法逐步被取代的過(guò)程中，鱟變形細(xì)胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）檢測(cè)法成為熱原檢測(cè)的重要替代方法。該方法利用鱟血變形細(xì)胞提取物通過(guò)凝血技術(shù)檢測(cè)內(nèi)毒素，靈敏度高達(dá)0.005EU/ml，遠(yuǎn)高于兔熱原試驗(yàn)（0.5-3EU/ml）。隨著不斷改進(jìn)，從凝膠凝塊檢測(cè)法發(fā)展到濁度測(cè)定法和顯色鱟試劑檢測(cè)法，靈敏度可達(dá)0.001EU/ml。

但LAL檢測(cè)法也存在不少問(wèn)題。它易受多種無(wú)害物質(zhì)影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性，只能檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，無(wú)法檢測(cè)非內(nèi)毒素致熱原或其他污染物的增效作用，而且獲取鱟血淋巴會(huì)對(duì)馬蹄蟹種群產(chǎn)生影響。因此，人們?nèi)栽诓粩鄬ふ腋鼮槔硐氲臒嵩瓩z測(cè)方法。

三、新型檢測(cè)方法：重組試劑與單核細(xì)胞活化試驗(yàn)

2024年11月，《美國(guó)藥典-國(guó)家處方集》（USP-NF）正式納入了第86章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試"，并宣布該章節(jié)于2025年5月起正式生效。其中，PyroSmartNextGen®重組鱟試劑作為全-球-首-款完整的重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），完-全模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯(lián)反應(yīng)，剔除了容易引起假陽(yáng)性的G因子，且不依賴鱟血，符合可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。

盡管LAL檢測(cè)法在靈敏度等方面有所提升，但它更像是RPT的補(bǔ)充而非替代。因?yàn)槠渑c哺乳動(dòng)物的熱原反應(yīng)機(jī)制存在差異，只能評(píng)估液體樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素，使用的系統(tǒng)也與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)不同，可能無(wú)法反映樣本的真實(shí)熱原潛力，所以和RPT一樣，LAL試驗(yàn)也不能完-全預(yù)測(cè)人體對(duì)試驗(yàn)物質(zhì)的反應(yīng)。

隨著對(duì)發(fā)熱反應(yīng)分子機(jī)制研究的深入，單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（Monocyte-Activation Test，MAT）作為一種體外熱原檢測(cè)方法逐漸嶄露頭角。MAT利用人體全血與熱原接觸后產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）來(lái)評(píng)估熱原污染，能模擬人體先天免疫系統(tǒng)反應(yīng)。它不僅能檢測(cè)各種熱原污染物，包括未定性熱原和非內(nèi)毒素，還能檢測(cè)塑料、金屬、植入物和醫(yī)療器械等固體材料。

MAT于2010年和2012年分別被納入《歐洲藥典》和《美國(guó)藥典》。該方法有多種變體，提供不同的人類單核細(xì)胞來(lái)源，如全血、分離的原始單核細(xì)胞（如PBMC）或單核細(xì)胞系。雖然相比rCR檢測(cè)法，MAT存在供體變異導(dǎo)致靈敏度偏差和檢測(cè)范圍較窄的問(wèn)題，但可以對(duì)熱原進(jìn)行定量，且使用全血及其成分更可能再現(xiàn)體內(nèi)反應(yīng)。

盡管新鮮全血的可獲得性有限，但可以通過(guò)低溫保存的血液或白細(xì)胞介素(PBMC)來(lái)解決。驗(yàn)證研究表明，全血含有對(duì)熱原反應(yīng)的必要成分，且熱原刺激的分子機(jī)制已成功應(yīng)用于體外模型中。

四、總結(jié)：綜合選擇，保障用藥安全

在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，熱原檢測(cè)對(duì)于保證腸外藥品、醫(yī)療器械、生物制劑等直接或間接進(jìn)入血液物質(zhì)的質(zhì)量與安全意義重大。家兔熱原試驗(yàn)（RPT）、鱟變形細(xì)胞裂解物（LAL）試驗(yàn)和單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況合理選擇檢測(cè)方法，以最-大-程-度保障患者用藥安全。